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    iTRAQ
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    簡介INTRODUCTION

    同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ) 蛋白質組學技術

    Isobaric Tags for Relative andAbsolute Quantization (iTRAQ) proteome technology

    同位素標記相對和絕對定量iTRAQ(Isobaric tags for Relative andAbsolute Quantitation)技術是由美國應用生物系統公司(Applied BiosystemsIncorporation,ABI)開發的一種多肽體外標記技術。該技術采用了4種( iTRAQ? reagents – 4plex)或8種( iTRAQ? reagents – 8plex )同位素標簽,通過標記肽段(Peptide)特異氨基酸位點,然后進行串聯質譜分析,可靈活比較最多8種不同樣本中蛋白質的相對含量和絕對含量。

    技術原理PRINCIPLE

    iTRAQ實驗中,經過蛋白質提取獲得組織細胞中的全蛋白,全蛋白在胰酶作用下被酶解(Trypsin Digestion)成肽段,iTRAQ試劑對所獲得的全部肽段進行標記。iTRAQ試劑主要由3部分組成:報告基團(Reportgroup)、平衡基團(Balancegroup)和肽反應基團(Amine-specificreactive group)。以4標試劑為例:報告基團相對分子質量分別為114、115、116和117;平衡基團相對分子質量分別為31、30、29和28,肽反應基團將iTRAQ試劑與肽段上賴氨酸(Lysine,K)及N端氨基酸殘基相連,在其上4種報告基團通過平衡基團與反應基團相連,這樣就形成了4種相對分子質量均為145的等量異位標簽。

    iTRAQ試劑在標記肽段樣本后,報告基團和平衡基團的平衡分子量都為145,因此改變任一iTRAQ試劑,不同同位素標記的同一多肽在第一級質譜檢測中分子量都完全相同。而在串聯質譜(MSMS)中,同重元素標記肽段的報告基團、平衡基團和肽反應基團之間的連接鍵斷裂,平衡基團中性丟失,同時不同同位素標簽的同一肽段產生不同的質荷比(114-117)的峰。因此,根據波峰的高度和面積,可獲得樣品間相同肽段的定量信息,再經過軟件處理得到肽段和蛋白質的定量信息。

    技術特點CHARACTERISTIC

    1.較雙向電泳(2D Electrophoresis)優勢

    iTRAQ技術不僅可以發現到更多的胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白,同時還可以檢測到2D技術較難發現的低豐度蛋白、疏水性蛋白、等電點極酸和極堿蛋白、分子量極低極高蛋白(小于10kDa或大于200KDa)。

    2. 分析時間快、實驗誤差小

    可在一次實驗中同時完成最多8組樣本的比較,不僅減少了實驗誤差和縮短了實驗周期,而且增加了實驗統計的相關性。

    3. 分析范圍廣

    iTRAQ試劑幾乎可以與樣本中所有的蛋白結合,同時因為是體外標記,所以對各種動植物組織、微生物、血液、體液、細胞培養物以及分泌物等樣本均可進行分析。

    4. 可信度高

    現代串聯質譜具備掃描速度快、精度高等特點,使其二級碎片離子信號增強,產生質量更高的二級質譜,確保鑒定結果高的可信度。同時,標記試劑的報告離子的相對分子質量較低(均不超過121),低分子量區是質譜定性和定量較為準確的區域,因此檢測結果更為靈敏可靠。

    5. 翻譯后修飾分析

    保留了肽段轉錄后修飾的狀態,因此可對磷酸化蛋白等翻譯后修飾蛋白進行定性和定量研究。

    技術流程PROCESS

    iTRAQ實驗流程主要包括:樣品蛋白質提取,蛋白質酶解,標記,SCX分級,質譜測試和數據庫檢索。

    Step 1. 樣品蛋白質提取

    因為iTRAQ實驗摒棄了2D凝膠實驗,通常在2D實驗中需要的高濃度的尿素裂解可以不再使用,我們選用了裂解效率更高的SDT裂解液來進行蛋白質提取。在完成制備工作以后,我們會進行1D SDS-PAGE電泳(質控點1)來評判樣品的蛋白質是否有降解以及樣品之間的平行性如何。

    Step 2. 蛋白質酶解

    我們采用最新的FASP方法進行酶解,酶解肽段我們進行內部的液相-質譜測試,搜庫和結果分析。此步為我們的質控點2,主要是評判酶解肽段的平行性和確定物種數據庫。

    Step 3. iTRAQ試劑標記

    每份樣品的100ug肽段進行iTRAQ試劑的標記。標記完成后,我們進行質控點3,利用MALDI質譜確認iTRAQ的標記效率和平行性。

    Step 4. SCX分析(可選)

    標記好的樣品在合并完成之后進行SCX分級。現代質譜在一次實驗中已可以同時完成對幾千個蛋白質的定性和定量工作。但是在樣品中的低豐度蛋白質,比如轉錄因子等,它們的質譜信號可能會被樣品中的高豐度蛋白所掩蓋。所以根據Step1和Step2中預備實驗結果和前期我們根據文獻的指導以決定是否進行SCX分級以及分級的級數。

    Step 5 質譜測試

    SCX分級的樣品經過脫鹽凍干之后即可上機進行測試。

    Step 6 搜庫分析

    質譜原始數據經過專業軟件和蛋白質庫進行比對分析,得到得到蛋白質的定性和定量信息。

    樣本要求REQUIREMENT OF SAMPLE

    樣品要求:

    1. 最好送原始樣本,除非客戶有成熟的蛋白質組學的蛋白提取方法。

    2. 動物組織樣品:濕重不少于200 mg,樣品不能溶血,取材后用PBS沖洗3遍去除血液。

    3. 植物組織樣品:濕重不少于1 g,取材后用PBS沖洗3遍去除雜質污染。

    4. 菌體樣品:原則上只接受常見無毒菌的菌體樣品,菌體沉淀不少于100 mg或者體積不少于100 μL;若為含有毒菌的菌體樣品或菌體  裂解液,按照《病原微生物技術服務操作指南》執行。

    5. 細胞樣品:收集細胞沉淀,PBS沖洗3遍,送樣量為5×106或細胞沉淀不少于50 μL。

    6. 培養基上清液:需保證無菌體或細胞(用0.2 μm膜過濾),有條件的話可濃縮后再寄送;送樣體積不少于10 ml。

    7. 血清樣品:新鮮血液取出后,4℃,2000 g,離心15 min,取上清,即得血清;血清制備過程中保證不能溶血;血清體積要求不少于500 μl;制備血清過程中,客戶可根據自己的樣品和實驗要求選擇是否添加抗凝劑,一般不用添加。

    8. 若客戶直接提供蛋白,則蛋白量不少于1 mg,濃度不低于2 mg/mL。

    送樣要求:

    1. 寄送溫度

    • a) 膠條樣品:冰袋環境;
    • b) 組織、菌體、細胞沉淀、血清、培養基上清和蛋白提取液:樣品收集好后立即置于液氮中冷凍5 min,-80℃保存,所有樣品收集好后干冰環境寄送;
    • c) 細胞:凍存細胞干冰寄送;培養中的細胞需保證狀態良好,培養瓶中裝滿培養基,常溫寄送;

    2. 寄送樣品時附上填寫完整的紙質版樣品信息單(務必包含樣品物種拉丁名及數據庫、樣品標識名稱,管數,分組對比信息)。

    3. 樣品標記清晰明確,與樣品信息單中保持一致,不同項目的樣品量參考如下所述。

    FAQFAQ

    1. 關于樣品重復的問題?

    最優的實驗設計是每組樣品設置至少三個生物學重復,比如有A和B兩組,最優是提供A1、A2、A3、B1、B2、B3共6個樣品;其次是技術重復,只有A和B兩個樣本,沒有生物學重復,推薦做A和B 各3次平行的質譜技術重復。最后是否做生物學重復或者技術重復,還可以有一些其他考慮:如果實驗本身在整個研究中處于后期的驗證,或者是一個前期的開始,可以考慮1次重復;類似血清或者分泌液的樣本也可以做1次重復。無論最后的重復如何設計,一個嚴謹的設計都需要后期對潛在蛋白質的驗證,比如Realtime-PCR,Western-Blot,ELISA等。

    2. iTRAQ實驗對樣品的要求?

    a.植物類葉片樣本:濕重≥1g;

    b.植物富含雜質或蛋白含量低的樣本,如植物根,根莖、木質部、韌皮部組織等:干重≥5g;

    c.細胞樣本數目須達到:107(建議使用我們的裂解液進行裂解之后再進行寄送);

    d.新鮮人,動物組織:≥100mg;

    e.血清/血漿≥500μl;

    f.尿液≥25mL;

    g.唾液、羊水、腦脊液等體液≥5mL;

    h.其他特殊樣本如有疑問請聯系我們。

    3. iTRAQ實驗一次可以做多少個樣本?

    理論上利用一個8標試劑盒,一次實驗最多可以做8個樣本。但如果在所有的實驗里面設置內標的話,就可以把多個8標實驗關聯起來,這樣就可以做超過8個樣本的iTRAQ實驗了。

    4.通過iTRAQ找到的候選蛋白會與其他蛋白的變化趨勢保持一致嗎?

    做為一個高通量的實驗,iTRAQ最主要的目的是發現一些可能有意義的潛在蛋白,對表型的表現從蛋白的層面上去找一些可能的證據,是一個“發現”過程,需要后期通過其他的實驗區再次驗證。所以,在一個iTRAQ實驗開始之前,我們不會就某個特殊的蛋白質的檢出,以及顯著性和變化倍數等做出保證。

    5. 為什么要設計預備實驗?

    設置預備實驗室將整個iTRAQ實驗的風險降至最低。通過預備實驗結果我們就可以大致判斷最后整體實驗的情況。比如有些菌類樣本,即便在SDS-PAGE圖,以及質譜的Basepeak圖都是一樣的,可以搜完庫之后鑒定得到的蛋白質數據會相差比較大,出現這種情況就很有可能是該菌有其他雜菌的污染,如果沒有預備實驗,這樣的情況可能會比較難排查。


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